慢病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-CMV-EGFP-gene或者pLKO-U6-shRNA-EGFP-puro。其中pspax2, pMD2G是辅助质粒，另一个是骨架载体，骨架载体上的EGFP能表达绿色荧光蛋白（GFP），过表达的基因以及敲低序列shRNA均构建在慢病毒骨架载体上

慢病毒感染后表达GFP绿色荧光

1. 实验前准备

1. 细胞选择

   选择适合的靶细胞（如HEK293、HeLa、HepG2等），确保细胞状态良好。

2. 提前预实验确定细胞对慢病毒感染的敏感性（如MOI值）。

 

2. 病毒感染

 

1. 将靶细胞接种至培养板（如6孔板，一般接种密度在1-1.5x10^6cells/ml），确保次日细胞密度约60%-80%汇合。

 

2. 加入适当体积的慢病毒液（根据MOI计算）和聚凝胺（Polybrene，终浓度6-8 μg/mL），培养24-48小时;悬浮细胞接种当天就可以做病毒感染，在离心管中孵育半小时后，再重悬接种到孔板中培养，感染效果更好。

 

3. 吸除含病毒的培养基，更换为正常完全培养基，继续培养24-48小时。

                          

3. 抗生素筛选

1. 确定抗生素浓度

 

   预实验确定细胞的最低致死抗生素浓度（如嘌呤霉素常用浓度1-10 μg/mL，不同细胞需优化）。

 

2. 筛选稳转株

 

   在培养基中加入抗生素，每2-3天更换一次含药培养基。

 

   持续筛选约5-7天，直至未感染对照组细胞全部死亡，剩余细胞为潜在阳性克隆。

 

4. 单克隆扩增

1. 单细胞分离

 

  有限稀释法：将筛选后的细胞稀释至0.5-1细胞/孔，接种至96孔板。

 

  或使用克隆环（cloning ring）挑取单克隆。

 

2. 扩增培养

 

  培养2-3周，定期观察单克隆生长，扩大培养至6孔板或培养瓶。

 

5. 验证稳转株

1. 目的基因表达验证

 

通过qPCR检测目的基因的mRNA水平。

 

Western blot检测目的蛋白表达（若为过表达载体）。

 

若为荧光标记（如GFP），可通过流式细胞术分析荧光阳性率。

 

2. 功能验证

 

根据实验目的进行功能检测（如增殖、凋亡、信号通路分析等）。

 

6. 注意事项

1. 优化MOI和抗生素浓度：不同细胞系差异大，需预实验确定。

 

2. 避免污染：抗生素筛选阶段严格无菌操作。

 

3. 单克隆保种：及时冻存阳性单克隆细胞株。

 

简易流程图

病毒感染 → 抗生素筛选（5-7天） → 单克隆分离 → 扩增培养 → 验证（qPCR/WB/流式）→ 冻存

此流程通常耗时3-4周，具体时间因细胞类型和实验条件而异。若需要更高效筛选，可使用荧光标记（如GFP）辅助分选（FACS）。