敲除慢病毒是一种基于CRISPR/Cas9技术的基因编辑工具，通过将Cas9酶、sgRNA（单导向RNA）以及puromycin抗性基因整合到慢病毒载体中，实现对目标基因的敲除。这种技术利用慢病毒作为载体，能够高效地将基因编辑工具递送至宿主细胞，并通过CRISPR/Cas9系统实现基因的永久性敲除。

1. 慢病毒敲除慢病毒的组成
   慢病毒敲除慢病毒通常包含以下组件：

   • Cas9蛋白：负责DNA切割。
   • sgRNA：引导Cas9定位到特定的基因靶点。
   • puromycin抗性基因：用于筛选成功感染并敲除目标基因的细胞。

      

2. 操作流程

   • 慢病毒制备：通过包装系统将Cas9、sgRNA和抗性基因整合到慢病毒载体中，生成高滴度的慢病毒。
   • 感染细胞：将慢病毒与目标细胞共同培养，使用Polybrene等辅助因子提高感染效率。
   • 筛选与鉴定：

• 确定puromycin的筛选浓度，通常通过梯度浓度测试确定。
• 使用T7EI法验证sgRNA的活性，确保其能够有效切割目标基因。
• 对多克隆细胞进行筛选，选择无 puromycin 抗性的细胞；单克隆筛选则通过PCR或测序确认目标基因是否被敲除